Zn ^2+は単離されたニドウイルスRTCのRNA合成活性を可逆的に阻害する

我々は以前、 SARS-CoVまたはEAVに感染した細胞から単離したRTCのin vitro RNA合成活性を研究するためのアッセイを開発した[25]、[26]。これらのRTCアッセイでは、[α- ^32P ]CMPがゲノム（複製）とsg mRNA（転写）の両方に組み込まれている（図2) 。これにより、ニドウイルス感染細胞からのRNAのハイブリダイゼーションによって検出できるのと同じウイルスRNA分子の合成をモニターすることができました。これらのアッセイの利点は、活性が継続的なタンパク質合成に依存せず、ウイルス複製サイクルの他の側面から独立してウイルスRNA合成を研究できることです[26] 。細胞培養におけるニドウイルス複製に対するPTおよび亜鉛イオンの阻害効果が、ウイルスRNA合成に対するZn ²⁺の直接的な効果に反映されているかどうかを調べるために、Zn ²⁺添加がRTC活性に及ぼす影響をテストしました。EAV（図2A) および SARS-CoV (図2B_{)、ZnOAc 2}が存在すると、合成される RNA の量が用量依存的に減少することが観察されました。両方のウイルスにおいて、50 µM の Zn ^{2+濃度で全体的な RNA 合成の 50% 以上の減少が観察されましたが、500 µM の Zn 2+}濃度では 5% 未満の活性が維持されました。ゲノム合成と sg mRNA 生成の両方が同様に影響を受けました。

^{Zn 2+}によるRTC活性の阻害が可逆的であるかどうかを試験するために、500 µM Zn ²⁺の存在下または非存在下でRTC反応を開始した。30分後、これらの反応を2つのアリコートに分割し、マグネシウム飽和EDTA（MgEDTA）をチューブの1つに最終濃度1 mM（図3A）。これらのin vitroアッセイでは、Zn ^{2+キレート剤としてMgEDTAを使用しました。これは、ZnEDTA複合体の安定定数が高いため、Mg 2+}を放出しながらZn ^2+を特異的にキレートするためです。複合体を形成していないEDTAは、すべての反応でRTC活性を阻害しました（データ未掲載）。これは、RdRp活性に重要なMg ^{2+をキレートすることによってであると考えられます}[27]、[28] 。一方、MgEDTAは、Zn ²⁺を含まない対照反応には影響を与えませんでした（図3Bレーン1とレーン2を比較してください。図2、EAV RTC活性はZn ²⁺によって阻害された（図3B&C、レーン3）は、MgEDTA（図3B^{、レーン4）を、Zn2 +を}含まない対照反応で観察されたレベル（図3B、レーン1）。未処理のコントロールと比較して、EAV RTCアッセイでは約30％少ないRNAが生成され、これはMgEDTAの添加後の反応時間が30％短くなったことと一致していました（レーン1と4ではそれぞれ100分対70分）。驚くべきことに、Zn ²⁺とMgEDTAを連続して補充したSARS-CoV RTCアッセイでは、未処理のコントロール反応と比較してわずかに多くの[α- ³² P]CMPが組み込まれました（図3C^{レーン1とレーン4を比較してください。この効果は、SARS-CoV感染細胞の核後上清（PNS）にすでに存在するZn 2+}のキレート化によるものではなく、Zn ²⁺を追加せずにMgEDTAを対照反応に加えた場合にはこの増加は観察されませんでした（図3C、レーン2）。

亜鉛イオンは組み換えニドウイルスRdRpsのin vitro活性に影響を与える

^{RTC活性の阻害がZn 2+}のニドウイルスRdRp活性への直接的な影響によるものであるかどうかを確認するために、我々はSARS-CoV（nsp12）とEAV（nsp9）の精製組換えRdRpの活性に対するZn 2+^{の影響を、以前に開発されたRdRpアッセイ}[27]、[28]を使用してテストしました。18-merポリUテンプレートを使用して、EAV RdRpは最大18 ntの長さのRNA産物に[α- ^{32 P]AMPを組み込みました（}図4A）。開始はde novoであり、これは以前の観察と nsp9 配列に保存されたプライミングループの存在と一致している[28]。EAV RdRp nsp9 とは異なり、プライミングループを欠く SARS-CoV RdRp nsp12 のin vitro活性は厳密にプライマー依存的であることが示された[27]。したがって、SARS-CoV nsp12 の RdRp 活性を研究するために、プライミングされたポリU テンプレートが使用された (図4B^{) 、これにより、以前説明したように [α- 32} P]AMP の取り込みをサンプリングすることができました[27]。特異性コントロールとして、以前説明した SARS-CoV nsp12 変異体 D618A [27]（RdRp 活性部位のモチーフ A にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む）と、EAV nsp9 の対応する部位でアスパラギン酸からアラニンへの置換を操作した EAV nsp9-D445A [28]、[31]を使用しました。両方の変異 RdRp は、私たちのアッセイで [α- ³² P]AMP の取り込みが大幅に減少しました（図4）、放射性標識RNA産物がニドウイルスRdRp活性に由来することを再度確認しました。

RdRpアッセイにZnOAc ₂を添加すると、EAVとSARS-CoV酵素の両方の酵素活性が用量依存的に強く阻害された（図5AとB、それぞれ）が観察され、RTCアッセイで観察されたものと同様であった。実際、硫黄基ではなく酸素原子を含むアミノ酸側鎖に結合するCo ²⁺や Ca ^{2+などの他の二価金属イオンと比較して、Zn 2+ は}SARS-CoV nsp12 RdRp 活性の最も効率的な阻害剤であった（補足図 S1 ）。 RTCアッセイと同様に、亜鉛イオンによる RdRp 阻害が可逆的であるかどうかをテストするために、RdRp アッセイを 6 mM Zn ²⁺でプレインキュベートした。この濃度は、一貫して 95% を超える阻害を示した。 30 分後、8 mM MgEDTA をコントロール反応と ZnOAc ₂で阻害した反応の両方に加え、サンプルをさらに 30 分間インキュベートした（図5C）。 に示すように図5D^{、Zn 2+}によるEAV RdRp活性の阻害は、 Zn ²⁺のキレート化によって逆転する可能性がある（図5D;レーン3と4を比較してください。合成された生成物の量は、60分間のコントロール反応で合成された量の60±5%でした（図5D;レーン1と4を比較してください)、これは反応時間が短いことを考慮すると予想範囲内でした。SARS-CoV RdRpの阻害も可逆的でした。MgEDTA添加後の30分間のインキュベーション中に、SARS-CoV nsp12は標準的な60分間の反応中に取り込まれたラベルの40±5％を取り込みました（図5E^{これは予想された収量よりわずかに低く、Mg 2+}濃度の上昇によって引き起こされた可能性がある。これはnsp12活性にとって最適ではないことが示されており[27] 、Zn ²⁺のキレート化によりMgEDTAからMg ²⁺が放出されることに起因している。

ニドウイルスRNA合成の開始および伸長段階に対するZn ²⁺の異なる効果

EAVの場合、RdRpアッセイを詳細に調べたところ、全長18塩基の生成物の生成に対するZn ^{2+の影響は、より小さな反応中間体の合成に対する影響よりも顕著ではないことが明らかになった（}図5A）。これは、Zn ^2+がEAV RNA合成の開始段階を特異的に阻害することを示唆している。この仮説を検証するために、RTCアッセイを非標識CTP（開始）で30分間インキュベートし、その後、反応を2つに分割した。次に、[α- ³² P]CTPを両方のチューブに加え（パルス）、500 µM Zn ²⁺をチューブの1つに加え、反応中のさまざまな時点でサンプルを採取した（図6A）。図6B^{図は、Zn 2+}存在下では、[α- ³² P]CMP が主に新生 RNA 分子に組み込まれ、この新生 RNA 分子は Zn ²⁺が反応に加えられた時点ですでに開始段階を過ぎていたことを示しています。全長ゲノム RNA の位置に向かって徐々にシフトした短い放射性標識生成物のスメアによって示されるように、新たな開始は起こりませんでした。これは、Zn ^{2+ が}EAV RNA 合成の伸長段階には影響せず、開始を特異的に阻害することを示唆しています。これはまた、Zn 2+ 存在下で生成されるより小さな sg mRNA バンドの比較的弱い信号強度 ( 例えば、RNA2 と RNA7 の信号の相対的変化を比較してください ) を説明しています。これは、^長いゲノムRNAでの単一の開始イベントから生じる信号強度と同様の信号強度を得るには、これらの短い分子で複数の開始イベントが必要であり、例えば、RNA7 の場合は 16 倍多く必要となるためです。 EAVとは対照的に、SARS-CoV RTCによるRNA合成に対するZn ²⁺の効果は開始に限定されず、反応開始から40分後にZn ^{2+を添加すると[α- 32} P]CMPのさらなる取り込みが完全にブロックされたことを考えると、伸長段階も損なうように思われる（図6C）。

RdRpアッセイでは、短いテンプレートを使用したため、完全なRTCで行ったのと同様の実験を行うことは技術的に不可能でした。しかし、我々は以前、低濃度の[α- ³² P]ATP（約0.17 µM）では、SARS-CoV nsp12 RdRp活性はプライマーへの1ヌクレオチドの追加のみに制限されることに気付きました[27]。EAV nsp9は、主に非常に短い（2〜3 nt長）不完全RNA産物を生成し、全長産物の一部のみを生成しました。これは、 de novo開始RdRpsに共通する現象です[28] 。これにより、低濃度の[α- ³² P]ATPのパルスの後に50 µMの非標識ATPの存在下でチェイスを行う実験を行うことで、開始と伸長に対するZn ²⁺の影響を個別に研究することができました。これにより、プロセッシビティが向上し、伸長（図7AとC）を、以前に説明したように、鋳型から合成した。これらの実験結果は、単離RTCで得られた結果と一致した。EAVの場合、開始とジヌクレオチド合成が6 mM Zn ²⁺の存在によって完全に阻害され（補足図S2A）、18 nt未満の反応中間体の量は時間とともに減少したが、RdRpがすでに開始されている鋳型からの生成物は、全長18 nt分子に伸長した（図7B、右パネルこれは、EAV RdRpがZn ²⁺の存在下で合成ジヌクレオチドApAをトリヌクレオチドに延長する能力を維持しているという観察と一致している（補足図S2B）。これは、図に示した反応で再開始が見られなかったためである可能性が高い。図7B、EAV RdRpの低いプロセッシング性、および残存する[α- ³² P]ATPと200倍を超える非標識ATPとの間の基質競合により、5分と30分の時点の違いは小さかった。Zn ²⁺が存在しないと、RdRpは、全長産物の下にあるより小さなサイズのRNA分子のラダーによって示されるように、開始し続けた（図7B、左パネル）および補足図S2Aに示されている時間経過と相関した。対照的に、SARS-CoV RdRp反応にZn ^{2+を添加した場合も伸長が阻害された。これは、Zn 2+が存在しない場合に観察される放射性標識プライマーの伸長が、Zn 2+}が存在しない場合に観察されるのと同じであったためである（図7D、左パネル）は発生しなくなった（図7D、右パネル）。

細胞培養におけるニドウイルスの複製に対する亜鉛イオンの影響

感染前日に、Vero-E6細胞を透明または黒色（低蛍光）の96ウェルクラスターに1ウェルあたり10,000細胞で播種した。翌日、細胞をmoi 4でSARS-CoV-GFPまたはEAV-GFPに感染させ、感染後1時間で接種物を除去し、2％ウシ胎児血清（FCS）を含む培地100 µlを各ウェルに加えた。一部の実験では、0～2 µM ZnOAc ₂に加えて、0～32 µMのピリチオン（Sigma）を加えた。感染細胞を感染後17時間で、培地を吸引し、PBS中の3％パラホルムアルデヒドを加えることで固定した。PBSで洗浄した後、LB940 Mithrasプレートリーダー（Berthold）で485 nmの蛍光を測定してGFP発現を定量した。 ZnOAc ₂および PT の毒性を調べるため、細胞を 0～32 µM PT および 0～8 µM ZnOAc ₂に曝露しました。18 時間培養後、細胞生存率は Cell Titer 96 AQ MTS アッセイ (Promega) で測定しました。EC ₅₀および CC ₅₀値は、Graphpad Prism 5 の非線形回帰モデルを使用して計算しました。

RNAテンプレートとオリゴヌクレオチド

RNAオリゴヌクレオチドSAV557R（5′-GCUAUGUGAGAUUAAGUUAU-3′）、SAV481R（5′-UUUUUUUUUUAUAACUUAAUCUCACAUAGC-3′）およびポリ（U）₁₈（5′-UUUUUUUUUUUUUUUUU-3′）はEurogentecから購入し、7 M尿素/15％PAGEゲルから精製し、NAP-10カラム（GEヘルスケア）で脱塩した。 RNA 二重鎖 SAV557R/SAV481R をアニールするために、オリゴヌクレオチドをアニーリング バッファー (20 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl、5 mM EDTA) で等モル比で混合し、90°C に加熱して変性させ、室温までゆっくり冷却した後、15% 非変性 PAGE ゲルから精製しました。

単離RTCを用いたin vitroウイルスRNA合成アッセイ

SARS-CoVおよびEAV RTCは感染細胞から分離され、以前に記載されたようにin vitroで活性を測定した[25]、[26] 。Zn ²⁺の効果を評価するために、1 µlのZnOAc ₂ストック溶液を標準の28-µl反応に加え、最終的なZn ²⁺濃度が10～500 µMになるようにした。反応中にZn ^{2+をキレート化する必要がある場合は、マグネシウム飽和EDTA（MgEDTA）を最終濃度1 mMになるように加えた。RNAを単離した後、 32} P標識反応生成物を変性1%（SARS-CoV）または1.5%（EAV）アガロースホルムアルデヒドゲルで分離した。ウイルスRNAへの[α- ^32P ]CMPの取り込みは、Typhoonスキャナー（GE Healthcare）とImageQuant TL 7ソフトウェア（GE Healthcare）を使用して乾燥ゲルのリン光イメージングによって定量化されました。

ニドウイルスRdRpsの発現と精製

SARS-CoV nsp12およびEAV nsp9は、基本的に他の文献[27]、[28]で説明されているとおりに精製されたが、nsp9については改変が加えられた。簡単に説明すると、プラスミドpDEST14-nsp9-CHを含む大腸菌BL21(DE3)を、自己誘導培地ZYM-5052 [47]で37°Cで6時間、さらに20°Cで16時間培養した。緩衝液A（20 mM HEPES pH 7.4、200 mM NaCl、20 mMイミダゾール、および0.05% Tween-20）で溶解した後、上清をHisTrapカラム（GE Healthcare）に適用した。溶出は、緩衝液 A 中の 20～250 mM イミダゾールの勾配で行いました。nsp9 を含む画分は、Superdex 200 カラム (GE Healthcare) で 20 mM HEPES、300 mM NaCl、0.1% Tween-20 のゲルろ過によりさらに精製しました。nsp9-CH を含む画分をプールし、1000 倍量の緩衝液 B (20 mM HEPES、100 mM NaCl、1 mM DTT、50% グリセロール) に対して透析し、-20°C で保存しました。 D618A（SARS-CoV）またはD445A（EAV）変異を持つRdRpsは、他の文献で説明されているように、野生型（wt）プラスミドpDEST14-nsp9-CH [28]にオリゴヌクレオチド5′-TACTGCCTTGAAACA GCC CTGGAGAGTTGTGAT-3′および5′-ATCACAACTCTCCAG GGC TGTTTCAAGGCAGTA-3′を、およびプラスミドpASK3-Ub-nsp12-CHis ₆にオリゴヌクレオチド5′-CCTTATGGGTTGG GCT TATCCAAAATGTG-3′および5′-CACATTTTGGATA AGC CCAACCCATAAGGA-3′をそれぞれ導入した部位特異的変異誘発によって得られた[27]。変異タンパク質はwt酵素と並行して精製された。

精製酵素を用いたRdRpアッセイ

0.1µMの精製SARS-CoV nsp12を用いたRdRpアッセイの標準的な反応条件は、他の文献に記載されている[27] 。このアッセイにおけるZn2 ⁺の効果を調べるために、0～80mM _ZnOAc2の希釈系列0.5µlを5µlの反応混合物に加え、最終Zn2 ⁺濃度を0～8mMとした。 EAV RdRp アッセイには、1 µM nsp9、1 µM RNA テンプレート poly(U) ₁₈、0.17 µM [α- ³² P]ATP (0.5 µCi/µl; Perkin-Elmer)、50 µM ATP、20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM NaCl、10 mM KCl、1 mM MnCl ₂、4 mM MgOAc ₂、5% グリセロール、0.1% Triton-X100、1 mM DTT、および 0.5 単位 RNaseOUT が含まれていました。ZnOAc _{2 を}反応に加え、最終濃度が 0～6 mM になるようにしました。反応中に Zn ²⁺をキレート化するために、MgEDTA を最終濃度が 8 mM になるように加えました。反応は1時間後に終了し、[27]に記載の通りに分析した。