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亜鉛、ビタミンDの投与でコロナウイルスの感染予防効果や重症化抑制に効果が認められています。風邪や肺炎の感染予防や症状改善効果! 

以下は、https://nobuokakai.ecnet.jp/info/topic/1752/より引用しています。

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・~

 諸外国では、機能性食品成分に関する感染防御の検討がなされており、一定の有用性が示されています。特にビタミンや微量元素の感染防御効果が確かめられつつあります2)

現在、最も明らかなエビデンスがあるのはビタミンDです3)。ビタミンDの投与で感染予防効果や重症化抑制効果が認められています。同様に注目されているのが微量元素の亜鉛です4)。亜鉛は必須微量元素のひとつで、感染症領域では免疫関係に大きく関与することが解ってきました。亜鉛が欠乏すると、免疫機能が低下します。そしてその免疫不全の特徴は胸腺の萎縮とそれに伴う細胞性免疫の機能低下です。その他にも樹状細胞の活性低下、その他多くの免疫機能に障害が及んできます。つまり感染症に罹りやすくなります5)。実際、亜鉛欠乏では、風邪の原因ウイルス、単純ヘルペスウイルス、C型肝炎ウイルス、HIVウイルスなどのさまざまなウイルスの感染リスクが高まることが示されています。 また、亜鉛はコロナウイルスの複製を阻害します4)。コロナウイルスは、RNAウイルスに分類されます。RNAウイルスに対して、亜鉛は、RNAウイルスを複製する酵素であるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)を阻害することで、ウイルスの複製を防ぐ働きがあります4)

 また、亜鉛サプリメントによる風邪や肺炎の感染予防や症状改善効果が示されています。
これまでの亜鉛を投与した研究に関する系統的レビュー/メタ解析によると、
  - 成人における風邪の罹病期間が33%短縮、
  - 小児5,193 人では肺炎の罹患率が13%低下、
  - 成人2,216 人での重度の肺炎の死亡率が低下
といった亜鉛の効果が見出されました4)
 さて、肥満や糖尿病、高齢者などは、COVID-19の高リスク群です。これらの人々では、亜鉛が低値であることがわかっています。またこれらの疾患で服用される薬剤で亜鉛が低下することもわかっています。 降圧利尿剤、ACE阻害剤、ARBなどの高血圧治療薬、スタチン剤などです。実際、亜鉛不足はCOVID-19 感染の予後が悪くなること、重症化することなどが報告されています4)

 COVID-19感染に対する亜鉛投与の有効性はどうでしょうか?
 亜鉛の単独投与では細胞内の濃度を上昇させるのが難しく、亜鉛イオノフォアの併用投与が必要ですが、米国では、亜鉛+イオノフォアの投与により、COVID-19患者の院内死亡率が24%低下したという報告もあります4)。ただ、亜鉛の単独投与ではもちろん死亡率改善効果はなく、他の薬剤との併用投与で効果が認められていました。現在、亜鉛単独投与ではなく、ビタミンCやビタミンDとの併用投与によるランダム化比較試験が進行中です。
 亜鉛サプリメントは、適切な摂取量であれば、高い安全性が示されています。免疫能の維持など保健機能のための一般的な亜鉛サプリメントの摂取目安量は、1日あたり10mg~20mg前後です。症状の改善を目的とした場合、予防よりも多い量を数日間、摂取します。例えば、風邪に対する亜鉛の有用性を検証した臨床試験では、亜鉛を1日あたり80mgの用量で、数日間の投与が行われています4)

 本邦でも、亜鉛の摂取不足が示されており、特に、COVID-19の高リスク群である肥満や糖尿病などの生活習慣病有病者で顕著です。さらに、亜鉛の免疫調節作用や抗ウイルス作用は確立しており、積極的に摂取する必要があり、サプリメントの服用も考えるべきです。ただ、亜鉛を摂取しすぎると銅が低下しますので注意する必要があります。

菊池中央病院  中川 義久
令和3年6月21日

参考文献

1)新型コロナウイルス感染症(COVID-19)と栄養・睡眠・運動https://nobuokakai.ecnet.jp/info/topic/532/

2)東口 髙志ら:新型コロナウイルス感染症(COVID-19)の治療と予防に関する栄養学的提言 . 日本臨床栄養代謝学会 2020 ; 2 ; 84 – 94 .

3)ビタミン D が不⾜すると新型コロナウイルス感染症が重症になる

4)蒲原 聖可:新型コロナウイルス感染症(COVID-19)の予防および治療に関する亜鉛の臨床エビデンス . 医と食 2021 ; 13 ; 51 – 59 .

5)亜鉛と感染症
https://www.nobuokakai.ecnet.jp/nakagawa146.pdf

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以下は、上記記事の著者とは別記事となります。
関係資料として追加したものです。

 
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National Library of Medicine

 2010 Nov; 6(11): e1001176.
Published online 2010 Nov 4. doi: 10.1371/journal.ppat.1001176
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2973827/
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Zn 2+ はコロナウイルスとアルテリウイルスのRNAポリメラーゼ活性をin vitroで阻害し、

亜鉛イオンフォアは細胞培養におけるこれらのウイルスの複製を阻害する

ラウル・アンディーノ、編集者
 

関連データ

補足資料

抽象的な

ピリチオン (PT) などの亜鉛イオノフォアで細胞内の Zn 2+濃度を高めると、ポリオウイルスやインフルエンザウイルスなど、さまざまな RNA ウイルスの複製を効果的に阻害できます。一部のウイルスでは、この効果はウイルスのポリタンパク質処理の妨害に起因すると考えられています。この研究では、低濃度のZn 2+と PT の組み合わせ (2 µM Zn 2+と 2 µM PT) が、細胞培養における SARS コロナウイルス (SARS-CoV) と馬動脈炎ウイルス (EAV) の複製を阻害することを実証しています。これら 2 つの遠縁のニドウイルスの RNA 合成は、多タンパク質複製および転写複合体 (RTC) のコア酵素である RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRp) によって触媒されます。 SARS-CoV または EAV に感染した細胞から分離された RTC の活性アッセイを使用することで (これにより、PT が Zn 2+ を細胞膜を越えて輸送する必要がなくなり)、Zn 2+ が両方のウイルスの RTC の RNA 合成活性を効率的に阻害することが示されました。その後、大腸菌から精製された組み換え RdRps (SARS-CoV nsp12 および EAV nsp9) を使用した酵素研究では、 Zn 2+ が両方のニドウイルスポリメラーゼのin vitro活性を直接阻害することが明らかになりました。より具体的には、Zn 2+ はEAV RNA 合成の開始ステップをブロックすることがわかりましたが、SARS-CoV の場合は RdRp の伸長が阻害され、テンプレートの結合が減少しました。Zn 2+を MgEDTA でキレート化することで、二価陽イオンの阻害効果を逆転させることができ、ニドウイルスの複製と転写の分子の詳細をin vitro で研究するための新しい実験ツールを提供します。

著者概要

プラス鎖RNA(+RNA)ウイルスには、多くの重要な病原体が含まれます。ウイルスはさまざまな複製戦略を進化させてきましたが、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)がRNA合成機構のコア酵素として機能するという点で共通しています。RdRpは通常、ウイルスRNA、ウイルスおよび宿主タンパク質から組み立てられた膜関連複製複合体に埋め込まれています。ウイルス複製サイクルにおける重要な機能を考えると、RdRpは抗ウイルス研究の重要なターゲットです。細胞内Zn 2+濃度の上昇は、ウイルスポリタンパク質の正しいタンパク質分解処理を妨げるなど、多くのRNAウイルスの複製を効率的に損なうことが知られています。ここでは、コロナウイルスとアルテリウイルスの複製がZn 2+レベルの上昇によって阻害されることを示すだけでなく、単離された複製複合体と精製された組み換えRdRpの両方を使用して、この効果がニドウイルスRdRpの直接阻害に基づいている可能性があることを実証します。ここで説明したプロトコルの組み合わせは、ニドウイルス酵素複合体の機能に関する将来の研究にとって貴重なものとなるでしょう。

導入

亜鉛イオンは多くの異なる細胞プロセスに関与しており、さまざまな細胞酵素や転写因子の適切な折り畳みと活性に不可欠であることが証明されています。Zn 2+は、多くのウイルスタンパク質にとっても重要な補因子であると考えられます。しかし、遊離 Zn 2+の細胞内濃度はメタロチオネインによって比較的低いレベルに維持されています。これは、Zn 2+ が細胞内セカンドメッセンジャーとして機能し、濃度が上昇するとアポトーシスを引き起こしたり、タンパク質合成を低下させたりするためと考えられます[1][2][3]。興味深いことに、細胞培養研究では、高濃度のZn 2+や、ヒノキトール(HK)、ピロリジンジチオカルバメート(PDTC)、ピリチオン(PT)などのZn 2+の細胞内輸入を刺激する化合物の添加が、インフルエンザウイルス[4]、RSウイルス[5]、いくつかのピコルナウイルス[6][7]、 [8]、 [9]  [ 10][11]など、さまざまなRNAウイルスの複製を阻害することがわかりました。これらの以前の研究は限られたメカニズムの情報しか提供していませんが、これは細胞内Zn 2+レベルがこれらのウイルスの複製サイクルの共通ステップに影響を与えることを示唆しています。

細胞培養では、PTは数分以内にZn 2+の取り込みを刺激し、ピコルナウイルスについてのみかなり詳細に研究されているメカニズムを介してRNAウイルスの複製を阻害します[11][12]。精製されたライノウイルスおよびポリオウイルス3Cプロテアーゼを用いたin vitro研究では、プロテアーゼ活性がZn 2+によって阻害されることが明らかになりました [13][14]。これは、ヒトライノウイルスおよびコクサッキーウイルスB3に感染した細胞で観察された亜鉛イオンによるポリタンパク質処理の阻害と一致しています[11] 。しかし、インフルエンザウイルスなどの分節マイナス鎖RNAウイルスの複製はポリタンパク質処理に依存せず、PDTCを介したZn 2+輸入の効果は、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)および細胞補因子の阻害から生じると仮定されました[4]。さらに、ライノウイルスやC型肝炎ウイルスから精製されたRdRpsの活性に対するZn2 +の阻害効果が認められたが、詳細は調査されていない[15][16]

ニドウイルスに対する亜鉛イオンの効果の詳細は、現在のところほとんどわかっていません。プラス鎖RNA(+RNA)ウイルスのこの大きなグループには、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、その他のヒトコロナウイルス、アルテリウイルスの馬動脈炎ウイルス(EAV)、および豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)など、ヒトと家畜の主要な病原体が含まれます[17] , [18]。ニドウイルスの共通の祖先は、類似したゲノム構成と発現戦略、および大きなレプリカーゼポリタンパク質におけるいくつかの重要な酵素機能の保存に反映されています[19]。コロナウイルスとアルテリウイルスの複製サイクルの特徴は、ウイルスの構造遺伝子とアクセサリタンパク質遺伝子が発現される5’末端と3’末端のネストされたサブゲノム(sg)mRNAのセットの転写です[20] , [21]

ピコルナウイルスと同様に[13][22]、亜鉛イオンは、感染細胞および無細胞システムにおけるコロナウイルスレプリカーゼポリタンパク質の処理における特定のタンパク質分解切断を阻害することが実証されています[23][24]。本研究では、亜鉛イオノフォアピリチオン(PT)とZn 2+の組み合わせが、細胞培養におけるSARSコロナウイルス(SARS-CoV)および馬動脈炎ウイルス(EAV)の複製の強力な阻害剤であることを報告する。タンパク質分解処理への可能性のある影響以外に、ニドウイルスRTCサブユニットおよびRNA合成がZn 2+によって直接影響を受けるかどうかを評価するために、感染細胞から単離された膜結合RTCに基づくSARS-CoVおよびEAV RNA合成用のin vitroシステム(以下、RTCアッセイと呼ぶ)[25][26]を採用した。さらに、我々は試験管内組換えRdRpアッセイを用いて、亜鉛イオンがSARS-CoVとEAVのRdRpに及ぼす影響を直接研究した[27][28]

これらの独立したin vitroアプローチを使用して、Zn 2+がRTCアッセイとRdRpアッセイの両方で強力な阻害効果を示したため、Zn 2+がニドウイルスRNA合成を直接阻害することを実証することができました。興味深いことに、Zn 2+媒介阻害は、Zn 2+キレート剤(MgEDTA)の添加によって逆転させることができました。したがって、この化合物を使用して、in vitro RNA合成活動を自由に停止および再開しました。この便利なツールにより、動脈およびコロナウイルスRNA合成のさまざまなメカニズムの側面をより詳細に研究することができました。さらに、ここで説明した亜鉛媒介ニドウイルスRNA合成阻害は、抗ウイルス療法における亜鉛イオノフォアの使用をさらに調査するための興味深い基礎を提供する可能性があります。

結果

亜鉛とピリチオンは生体内でニドウイルスの複製を阻害する

亜鉛イオンは多くの異なる細胞プロセスに関与しているが、遊離Zn 2+の濃度はメタロチオネインによって比較的低いレベルに維持されている[1]。Zn 2+と、PTなどの細胞へのZn 2+の輸入を刺激する化合物は、細胞培養においてライノウイルス、口蹄疫ウイルス、コクサッキーウイルス、メンゴウイルスを含むいくつかのピコルナウイルスの複製を阻害することが以前にわかっている[6][7][8][9][10][11]。Zn 2+がニドウイルスに対して同様の効果を持つかどうかを判断するために、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレポーターウイルス、すなわちEAV-GFP [29]とSARS- CoV-GFP [30]を使用して、Vero-E6細胞におけるEAVとSARS-CoVの複製に対するPTとZn 2+の効果を調査した。 EAV-GFP は、レプリカーゼポリタンパク質の切断産物の 1 つであるウイルス非構造タンパク質 2 (nsp2) への GFP の N 末端融合をコードし、レプリカーゼ遺伝子の翻訳の直接的な読み取りを提供します。SARS-CoV-GFP では、細胞培養での複製に不要な 2 つのアクセサリタンパク質コード遺伝子 (ORF 7a および 7b) の置換に続いて、sg mRNA 7 からレポーター発現が発生します。

まず、0~8µMのZnOAc2存在下で、さまざまな濃度(0~32µM)のPTの細胞毒性を評価した。32µMまでの濃度のPTと4µM未満のZnOAc2を併用した処理では、18時間後に模擬感染細胞の生存率が低下しなかった(図1A)、比色MTS(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)生存率アッセイで測定した。Zn 2+濃度の上昇は細胞翻訳を阻害することが知られているため、35 S-メチオニンによる代謝標識も使用して、PTとZn 2+の細胞タンパク質合成への効果を評価した。上記のPTとZn 2+の組み合わせでVero-E6細胞を18時間インキュベートし、その後2時間代謝標識したところ、ZnOAc 2の濃度が4 µM未満の場合は細胞全体のタンパク質合成に変化がないことが明らかになった(データ未掲載)。

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亜鉛イオノフォアピリチオンは細胞培養におけるニドウイルスの複製を阻害します。

A ) 18時間の曝露後にMTSアッセイで測定した、2µM(黒四角)、4µM(赤三角)、または8µM(灰色のダイヤモンド)のZnOAc 2の存在下または非存在下(青丸)でのVero-E6細胞におけるPTの細胞毒性。( B ) 感染後17時間でGFP発現EAVレポーター株に感染したVero-E6細胞におけるGFP蛍光に対するPTおよびZn 2+の効果を示す用量反応曲線。データは、感染した未処理のコントロール培養(100%)におけるGFP発現に対して正規化されています。培地に添加された異なるZn 2+濃度は、0(青丸)、1(緑三角)、または2µM ZnOAc 2(黒四角)でした。 (C)感染後17時間でGFP発現SARS-CoVレポーター株に感染したVero-E6細胞におけるPTとZn 2+のGFP蛍光に対する影響。データは感染した未処理のコントロール細胞(100%)のGFP発現に対して標準化した。異なるZn 2+濃度の色は、図1B誤差バーは標準偏差を示す(n = 4)。

これらの非細胞毒性条件を使用して、PT と ZnOAc 2 がEAV-GFP と SARS-CoV-GFP の複製に及ぼす影響を次にテストしました。この目的のために、96 ウェル プレートの Vero-E6 細胞を感染多重度 (moi) 4 で感染させました。感染後 1 時間 (h pi) に、0 ~ 32 µM の PT と 0、1、または 2 µM の ZnOAc 2を培養培地に加えました。感染後 17 時間 (未処理の感染細胞における GFP 発現が両方のウイルスで最大に達した時点) に、細胞を固定し、GFP 蛍光を定量化しました。

SARS-CoV-GFPとEAV-GFPの両方のレポーター遺伝子発現は、PT単独の添加によってすでに用量依存的に有意に阻害されていた(図1BとC)。この効果は、培地に2 µM の Zn 2+を添加すると大幅に強化されました。ZnOAc 2のみを添加してもウイルスの複製が減少することが分かりましたが、Vero-E6 細胞におけるZnOAc 2の 50% 細胞毒性濃度 (CC 50 ) (約 70 µM、データ未掲載)に近いレベルでのみ減少しました。これは、リン酸含有培地でのZn 2+の溶解性が低いことと、亜鉛イオンフォアがない場合の細胞によるZn 2+の取り込みが効率的でないことが原因であると考えられます。2 µM PT と 2 µM ZnOAc 2の組み合わせでは、EAV-GFP と SARS-CoV-GFP の GFP シグナルがそれぞれ 98±1% と 85±3% 減少しました。この PT と ZnOAc 2の濃度の組み合わせでは細胞毒性は観察されませんでした。図12µMの亜鉛存在下でPTのCC 50値は82µMと計算されました。SARS-CoVとEAVの半数阻害濃度(IC 50)はそれぞれ1.4µMと0.5µM、選択指数は59と164と計算されました。

Zn 2+は単離されたニドウイルスRTCのRNA合成活性を可逆的に阻害する

我々は以前、 SARS-CoVまたはEAVに感染した細胞から単離したRTCのin vitro RNA合成活性を研究するためのアッセイを開発した[25][26]。これらのRTCアッセイでは、[α- 32P ]CMPがゲノム(複製)とsg mRNA(転写)の両方に組み込まれている(図2) 。これにより、ニドウイルス感染細胞からのRNAのハイブリダイゼーションによって検出できるのと同じウイルスRNA分子の合成をモニターすることができました。これらのアッセイの利点は、活性が継続的なタンパク質合成に依存せず、ウイルス複製サイクルの他の側面から独立してウイルスRNA合成を研究できることです[26] 。細胞培養におけるニドウイルス複製に対するPTおよび亜鉛イオンの阻害効果が、ウイルスRNA合成に対するZn 2+の直接的な効果に反映されているかどうかを調べるために、Zn 2+添加がRTC活性に及ぼす影響をテストしました。EAV(図2A) および SARS-CoV (図2B)、ZnOAc 2が存在すると、合成される RNA の量が用量依存的に減少することが観察されました。両方のウイルスにおいて、50 µM の Zn 2+濃度で全体的な RNA 合成の 50% 以上の減少が観察されましたが、500 µM の Zn 2+濃度では 5% 未満の活性が維持されました。ゲノム合成と sg mRNA 生成の両方が同様に影響を受けました。

 

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単離されたRTCのin vitro RNA合成活性の​​Zn 2+による阻害。

各レーンの上部に示されているように、さまざまなZn 2+濃度の存在下でのRTCアッセイにおけるEAV(A)およびSARS-CoV(B )による[α- 32 P]CMPのウイルスRNAへの組み込み。

Zn 2+によるRTC活性の阻害が可逆的であるかどうかを試験するために、500 µM Zn 2+の存在下または非存在下でRTC反応を開始した。30分後、これらの反応を2つのアリコートに分割し、マグネシウム飽和EDTA(MgEDTA)をチューブの1つに最終濃度1 mM(図3A)。これらのin vitroアッセイでは、Zn 2+キレート剤としてMgEDTAを使用しました。これは、ZnEDTA複合体の安定定数が高いため、Mg 2+を放出しながらZn 2+を特異的にキレートするためです。複合体を形成していないEDTAは、すべての反応でRTC活性を阻害しました(データ未掲載)。これは、RdRp活性に重要なMg 2+をキレートすることによってであると考えられます[27][28] 。一方、MgEDTAは、Zn 2+を含まない対照反応には影響を与えませんでした(図3Bレーン1とレーン2を比較してください。図2、EAV RTC活性はZn 2+によって阻害された(図3B&C、レーン3)は、MgEDTA(図3B、レーン4)を、Zn2 +を含まない対照反応で観察されたレベル(図3B、レーン1)。未処理のコントロールと比較して、EAV RTCアッセイでは約30%少ないRNAが生成され、これはMgEDTAの添加後の反応時間が30%短くなったことと一致していました(レーン1と4ではそれぞれ100分対70分)。驚くべきことに、Zn 2+とMgEDTAを連続して補充したSARS-CoV RTCアッセイでは、未処理のコントロール反応と比較してわずかに多くの[α- 32 P]CMPが組み込まれました(図3Cレーン1とレーン4を比較してください。この効果は、SARS-CoV感染細胞の核後上清(PNS)にすでに存在するZn 2+のキレート化によるものではなく、Zn 2+を追加せずにMgEDTAを対照反応に加えた場合にはこの増加は観察されませんでした(図3C、レーン2)。

 

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Zn 2+によるニドウイルス RTC 活性の阻害は、キレート化によって元に戻すことができます。

A ) 単離されたRTCを用いたin vitroアッセイの模式図。アッセイは、[α- 32 P]CTPで開始され、500 µM Zn 2+の有無(サンプル1および2)で評価されました。30°Cで30分間インキュベートした後、未処理およびZn 2+処理サンプルの両方を2つのアリコートに分け、1 mM Zn 2+キレート剤MgEDTAをサンプル2および4に加えました。その後、すべての反応をさらに70分間インキュベートしてから終了しました。( B ) EAV RTCを用いたアッセイで合成されたRNA産物の分析。レーンの上の番号は、(A)で説明したサンプル番号を示しています。( C ) SARS-CoV RTCを用いたin vitro活性アッセイ。

亜鉛イオンは組み換えニドウイルスRdRpsのin vitro活性に影響を与える

RTC活性の阻害がZn 2+のニドウイルスRdRp活性への直接的な影響によるものであるかどうかを確認するために、我々はSARS-CoV(nsp12)とEAV(nsp9)の精製組換えRdRpの活性に対するZn 2+の影響を、以前に開発されたRdRpアッセイ[27][28]を使用してテストしました。18-merポリUテンプレートを使用して、EAV RdRpは最大18 ntの長さのRNA産物に[α- 32 P]AMPを組み込みました(図4A)。開始はde novoであり、これは以前の観察と nsp9 配列に保存されたプライミングループの存在と一致している[28]。EAV RdRp nsp9 とは異なり、プライミングループを欠く SARS-CoV RdRp nsp12 のin vitro活性は厳密にプライマー依存的であることが示された[27]。したがって、SARS-CoV nsp12 の RdRp 活性を研究するために、プライミングされたポリU テンプレートが使用された (図4B) 、これにより、以前説明したように [α- 32 P]AMP の取り込みをサンプリングすることができました[27]。特異性コントロールとして、以前説明した SARS-CoV nsp12 変異体 D618A [27](RdRp 活性部位のモチーフ A にアスパラギン酸からアラニンへの置換を含む)と、EAV nsp9 の対応する部位でアスパラギン酸からアラニンへの置換を操作した EAV nsp9-D445A [28][31]を使用しました。両方の変異 RdRp は、私たちのアッセイで [α- 32 P]AMP の取り込みが大幅に減少しました(図4)、放射性標識RNA産物がニドウイルスRdRp活性に由来することを再度確認しました。

 

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野生型酵素と活性部位変異体を用いた EAV および SARS-CoV RdRp アッセイ。

A ) EAVポリメラーゼはプライマー伸長が不可能で、開始するには遊離の3’末端とポリ(U)残基が必要でした。18-merポリ(U)テンプレート上の野生型酵素とnsp9のD445A変異体のヌクレオチド取り込み活性により、当社のアッセイの特異性が確認されました。( B ) SARS-CoV nsp12 RdRpアッセイは、5′ U 10オーバーハングを持つRNA二重鎖をテンプレートとして使用して実施しました。棒グラフは、野生型およびD618A nsp12のヌクレオチド取り込み活性を示しています。エラーバーは平均の標準誤差を表します(n = 3)。

RdRpアッセイにZnOAc 2を添加すると、EAVとSARS-CoV酵素の両方の酵素活性が用量依存的に強く阻害された(図5AとB、それぞれ)が観察され、RTCアッセイで観察されたものと同様であった。実際、硫黄基ではなく酸素原子を含むアミノ酸側鎖に結合するCo 2+や Ca 2+などの他の二価金属イオンと比較して、Zn 2+ はSARS-CoV nsp12 RdRp 活性の最も効率的な阻害剤であった(補足図 S1 )。 RTCアッセイと同様に、亜鉛イオンによる RdRp 阻害が可逆的であるかどうかをテストするために、RdRp アッセイを 6 mM Zn 2+でプレインキュベートした。この濃度は、一貫して 95% を超える阻害を示した。 30 分後、8 mM MgEDTA をコントロール反応と ZnOAc 2で阻害した反応の両方に加え、サンプルをさらに 30 分間インキュベートした(図5C)。 に示すように図5D、Zn 2+によるEAV RdRp活性の阻害は、 Zn 2+のキレート化によって逆転する可能性がある(図5D;レーン3と4を比較してください。合成された生成物の量は、60分間のコントロール反応で合成された量の60±5%でした(図5D;レーン1と4を比較してください)、これは反応時間が短いことを考慮すると予想範囲内でした。SARS-CoV RdRpの阻害も可逆的でした。MgEDTA添加後の30分間のインキュベーション中に、SARS-CoV nsp12は標準的な60分間の反応中に取り込まれたラベルの40±5%を取り込みました(図5Eこれは予想された収量よりわずかに低く、Mg 2+濃度の上昇によって引き起こされた可能性がある。これはnsp12活性にとって最適ではないことが示されており[27] 、Zn 2+のキレート化によりMgEDTAからMg 2+が放出されることに起因している。

 

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EAV および SARS-CoV の RdRps の活性は Zn 2+によって可逆的に阻害されます。

レーン上に示されているように、さまざまな Zn 2+濃度の存在下での精製された EAV nsp9 ( A ) および SARS-CoV nsp12 ( B ) の RdRp 活性。 ( C ) Zn 2+を介した RdRp 活性の阻害が MgEDTA で逆転できるかどうかをテストする実験の概略図。RdRp 反応、未処理のコントロール (サンプル 1 および 2) または 6 mM Zn 2+を含む反応(サンプル 3 および 4) を 30 分間インキュベートしました。Zn 2+を含むサンプルとコントロール サンプルの両方を 2 つのアリコートに分割し、6 mM MgEDTA をサンプル 2 および 4 に加えました。すべての反応をさらに 30 分間インキュベートした後、終了しました。EAV nsp9 および SARS-CoV nsp12 を使用した RdRp アッセイの反応生成物は、それぞれ ( D ) および ( E ) に示されています。レーンの上の数字は(C)で説明したサンプル番号を指します。

ニドウイルスRNA合成の開始および伸長段階に対するZn 2+の異なる効果

EAVの場合、RdRpアッセイを詳細に調べたところ、全長18塩基の生成物の生成に対するZn 2+の影響は、より小さな反応中間体の合成に対する影響よりも顕著ではないことが明らかになった(図5A)。これは、Zn 2+がEAV RNA合成の開始段階を特異的に阻害することを示唆している。この仮説を検証するために、RTCアッセイを非標識CTP(開始)で30分間インキュベートし、その後、反応を2つに分割した。次に、[α- 32 P]CTPを両方のチューブに加え(パルス)、500 µM Zn 2+をチューブの1つに加え、反応中のさまざまな時点でサンプルを採取した(図6A)。図6B図は、Zn 2+存在下では、[α- 32 P]CMP が主に新生 RNA 分子に組み込まれ、この新生 RNA 分子は Zn 2+が反応に加えられた時点ですでに開始段階を過ぎていたことを示しています。全長ゲノム RNA の位置に向かって徐々にシフトした短い放射性標識生成物のスメアによって示されるように、新たな開始は起こりませんでした。これは、Zn 2+ がEAV RNA 合成の伸長段階には影響せず、開始を特異的に阻害することを示唆しています。これはまた、Zn 2+ 存在下で生成されるより小さな sg mRNA バンドの比較的弱い信号強度 ( 例えば、RNA2 と RNA7 の信号の相対的変化を比較してください ) を説明しています。これは、長いゲノムRNAでの単一の開始イベントから生じる信号強度と同様の信号強度を得るには、これらの短い分子で複数の開始イベントが必要であり、例えば、RNA7 の場合は 16 倍多く必要となるためです。 EAVとは対照的に、SARS-CoV RTCによるRNA合成に対するZn 2+の効果は開始に限定されず、反応開始から40分後にZn 2+を添加すると[α- 32 P]CMPのさらなる取り込みが完全にブロックされたことを考えると、伸長段階も損なうように思われる(図6C)。

 

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分離された EAV および SARS-CoV RTC を用いたin vitroアッセイにおける開始および伸長に対するZn 2+の効果。

A )単離したEAV RTCを用いたin vitro RTCアッセイを、非標識NTP(開始)で開始した。30分後、[α- 32 P]CTPを添加し(パルス)、反応物を2つの等量に分割し、チューブの1つにZn 2+を最終濃度0.5 mMで添加した。示された時点でサンプルを採取し、[α- 32 P]CMPのウイルスRNAへの取り込みを分析した。( B ) レーン上に示した時点でZn 2+の存在下および非存在下で合成された放射標識EAV RNA。 ( C ) 100分後(レーン1)および40分後(レーン2)に反応を終了させた単離したSARS-CoV RTCによって合成された放射標識RNA。 40 分後に 500 µM Zn 2+を添加し、t = 100 で反応を終了させた反応生成物をレーン 3 に示します。

RdRpアッセイでは、短いテンプレートを使用したため、完全なRTCで行ったのと同様の実験を行うことは技術的に不可能でした。しかし、我々は以前、低濃度の[α- 32 P]ATP(約0.17 µM)では、SARS-CoV nsp12 RdRp活性はプライマーへの1ヌクレオチドの追加のみに制限されることに気付きました[27]。EAV nsp9は、主に非常に短い(2〜3 nt長)不完全RNA産物を生成し、全長産物の一部のみを生成しました。これは、 de novo開始RdRpsに共通する現象です[28] 。これにより、低濃度の[α- 32 P]ATPのパルスの後に50 µMの非標識ATPの存在下でチェイスを行う実験を行うことで、開始と伸長に対するZn 2+の影響を個別に研究することができました。これにより、プロセッシビティが向上し、伸長(図7AとC)を、以前に説明したように、鋳型から合成した。これらの実験結果は、単離RTCで得られた結果と一致した。EAVの場合、開始とジヌクレオチド合成が6 mM Zn 2+の存在によって完全に阻害され(補足図S2A)、18 nt未満の反応中間体の量は時間とともに減少したが、RdRpがすでに開始されている鋳型からの生成物は、全長18 nt分子に伸長した(図7B、右パネルこれは、EAV RdRpがZn 2+の存在下で合成ジヌクレオチドApAをトリヌクレオチドに延長する能力を維持しているという観察と一致している(補足図S2B)。これは、図に示した反応で再開始が見られなかったためである可能性が高い。図7B、EAV RdRpの低いプロセッシング性、および残存する[α- 32 P]ATPと200倍を超える非標識ATPとの間の基質競合により、5分と30分の時点の違いは小さかった。Zn 2+が存在しないと、RdRpは、全長産物の下にあるより小さなサイズのRNA分子のラダーによって示されるように、開始し続けた(図7B、左パネル)および補足図S2Aに示されている時間経過と相関した。対照的に、SARS-CoV RdRp反応にZn 2+を添加した場合も伸長が阻害された。これは、Zn 2+が存在しない場合に観察される放射性標識プライマーの伸長が、Zn 2+が存在しない場合に観察されるのと同じであったためである(図7D、左パネル)は発生しなくなった(図7D、右パネル)。

 

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精製された EAV および SARS-CoV RdRps の開始および伸長活性に対するZn 2+の効果。

A ) EAV RdRp反応は、伸長が起こらない条件、すなわちATP濃度が低い条件で、[α- 32 P]ATPの存在下で開始されました。20分後、反応物を2つの等量に分け、チューブの1つにZn 2+を加えました。伸長が起こる50 µMの非標識ATPによるチェイスを両方の反応で行い、5分後と30分後にサンプルを採取しました。( B ) 非標識ATPによる5分および30分のチェイス後、Zn 2+の存在下および非存在下で蓄積したEAV RdRp反応産物(レーンの上に表示)。反応産物の長さ(nt単位)はゲルの横に示されています。( C ) SARS-CoV RdRp反応は、伸長を制限する0.17 µMの[α- 32 P]ATPの存在下で開始されました。 10 分後、反応液を 2 つの等量に分け、チューブの 1 つに Zn 2+を加えた。両反応液に対して 50 µM の非標識 ATP によるチェイスを行い、5、10、15、30 分後にサンプルを採取した。( D ) レーン上部に示したチェイス時間に Zn 2+の存在下と非存在下で形成された SARS-CoV RdRp 反応産物。反応産物の長さ (nt 単位) はゲルの隣に示されている (p はプライマーの長さ)。

亜鉛はSARS-CoV RdRpテンプレートの結合に影響を与える

Zn 2+が組み換えSARS-CoV nsp12とアッセイに使用したテンプレートとの相互作用に影響を与えるかどうかを評価するために、Zn 2+の存在下と非存在下で電気移動度シフトアッセイ(EMSA)を実施しました(図8ARdRpのテンプレートに対する結合親和性を測定するために、様々なタンパク質濃度で結合したテンプレートの割合を決定し、アッセイ中にZn 2+が存在するとRNA結合が3~4倍減少することを観察した(図8B)。また、RdRp または RNA を Zn 2+とプレインキュベーションすることが、この結合親和性の低下に必要であるかどうかも評価しましたが、そのようなプレインキュベーションを行わない実験との有意差は見つかりませんでした (データは示していません)。

 

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SARS-CoV nsp12 テンプレート結合に対するZn 2+の効果。

A ) 放射性標識されたdsRNAとnsp12を用いた、Zn2 +存在下および非存在下(レーンの上に表示)での電気泳動移動度シフトアッセイ。ゲル内の未結合およびnsp12結合RNAの位置は、パネルの左側にマークされています。( B ) Zn2+存在下および非存在下でのRNAに対するnsp12親和性の測定。一定量のRNAを漸増量のnsp12とともにインキュベートしました。これにより、亜鉛イオン存在下(灰色)での結合RNAの割合が、亜鉛イオン非存在下(黒色)での結合RNAの割合と比較して3~4倍減少していることが明らかになりました。エラーバーは平均の標準誤差を表します(n = 3)。

精製されたEAV RdRpを用いて同様のRNA結合アッセイを行ったところ、結合は観察されなかった。同様に、nsp9は、Talonビーズ、His 6タグ付きnsp9、放射性標識されたEAVゲノムRNA、またはポリUを含むさまざまな短いRNAテンプレートを用いたプルダウン実験ではRNAに結合しなかったが、このアッセイを使用して、コントロールタンパク質(RNAおよびDNA結合活性を実証しているSARS-CoV nsp8 [32])の結合を検出することができた。組み換えEAV nsp9のRNAテンプレートへの結合を検出できない理由は現在のところ不明である。

議論

さまざまな化合物が研究されているが、SARSやその他のニドウイルス関連疾患の効果的な治療に有効な登録済みの抗ウイルス薬は現在まだ不足している[33]。RdRpは、その活性が厳密にウイルス特異的であり、主要な細胞機能に重大な影響を与えることなく阻害できるため、抗ウイルス薬開発に適したターゲットです。例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)やC型肝炎ウイルスのポリメラーゼに対して開発されたいくつかの阻害剤が、現在、抗ウイルス療法や臨床試験で使用されています[34][35][36]。したがって、ニドウイルスRdRpとそれらが一部であるより大きな酵素複合体に関する分子的知識を深め、最近開発されたin vitro RdRpアッセイ[25][26][27][28]の可能性を活用することは、最終的に効果的な抗ウイルス戦略の開発に役立つ可能性があります。

亜鉛イオンや亜鉛イオンフォア(PTやPDTCなど)は、これまでさまざまなRNAウイルスの強力な阻害剤として説明されてきました。そこで我々は、PT刺激による細胞内への亜鉛イオンの輸入が、細胞培養におけるニドウイルスの複製を阻害するかどうかを調査しました。GFP発現EAVおよびSARS-CoV [29][30]を使用して、2 µM PTと2 µM Zn 2+の組み合わせが、検出可能な細胞毒性を引き起こさずに、それらの複製を効率的に阻害することを発見しました(図1)。同様の濃度(2~10µM)でのPTとZn2+による複製阻害は、ライノウイルス、口蹄疫ウイルス、コクサッキーウイルス、メンゴウイルスなどのいくつかのピコルナウイルスで以前に観察されています[6][7][8][9][10][11]

ピコルナウイルスの複製に対する Zn 2+の阻害効果は、ウイルスのポリタンパク質処理の妨害によるものと思われます。コロナウイルスマウス肝炎ウイルス (MHV) の感染では、Zn 2+ はレプリカーゼポリタンパク質の切断の一部にも妨害を与えました[24]が、私たちの研究で使用した濃度よりもはるかに高い濃度 (100 µM Zn 2+ ) でした。レプリカーゼ処理の障害は感染細胞でのウイルス RNA 合成に間接的に影響するため、私たちは最近開発された 2 つのin vitroアッセイを使用して、Zn 2+ がニドウイルス RNA 合成に直接影響するかどうかを調べました。私たちのin vitro研究では、分離された EAV および SARS-CoV RTC の RNA 合成活性に対する亜鉛イオンの強力な阻害効果が明らかになりました。その後、組み換え酵素を使用したアッセイにより、これは RdRp 機能の直接阻害による可能性が高いことが実証されました。この阻害効果は亜鉛イオンをキレート化することで逆転させることができ、これはニドウイルスRNA合成を研究するための興味深い実験的(オン/オフ)アプローチを提供する。EAV RNA合成の開始後にZn 2+を添加しても、Zn 2+が存在しない状態ですでに合成が開始されていた分子へのNTPの取り込みにはほとんど影響がないか、まったく影響がなかった(図6そしてそして7)、7)、これはZn 2+が伸長に影響を与えず、Mn 2+で以前に発見されたように終結頻度を増加させないことを示している [25]。したがって、Zn 2+はEAV RNA合成の開始段階の特異的阻害剤であるように思われる。対照的に、Zn 2+はRNA合成の伸長段階でもSARS-CoV RdRp活性を阻害し、おそらくテンプレート結合に直接影響を与えることによって阻害した(図8)。コロナウイルスでは、亜鉛イオンはレプリカーゼポリタンパク質の適切なタンパク質分解処理[23][24]とRdRp活性(本研究)の両方を阻害するようです。RTCアッセイとは対照的に、RdRpアッセイでは、ヌクレオチドの取り込みをほぼ完全に阻害するために、マイクロモル濃度ではなくミリモル濃度のZnOAc2が必要でした。

DNA ポリメラーゼと RNA ポリメラーゼは、モチーフ A と C に保存されたアスパラギン酸残基の 3 つを使用して Mg 2+などの 2 価金属イオンを結合し、その後、重合反応中に入ってくるヌクレオチドを調整することが確立されています[37][38]。 Mg 2+ は、分離された SARS-CoV および EAV RTC と組み換え RdRp のin vitro活性に必要な 2 価金属イオンでもあります[25][26][27][28]。ただし、EAV nsp9 のde novo開始は主に Mn 2+に依存しています。 Zn 2+ は、 Mg 2+ が存在しない状態ではニドウイルス RTC と RdRp のポリメラーゼ活性をサポートできないため (データ未掲載)、補因子としてMg 2+または Mn 2+の代わりに使用することはできませんでした。これは、ポリオウイルス RdRp についても報告されています[39]。さらに、Zn 2+によるニドウイルス RdRp 活性の阻害は、低濃度でも、また Mg 2+が 25 倍以上過剰に存在する場合でも観察されており、これは、Zn 2+の活性部位の親和性が非常に高いか、または Zn 2+ がMg 2+結合と競合せず、タンパク質内の別の亜鉛 (特異的) 結合部位に結合することを示唆しています。

亜鉛イオンを含む特定のタンパク質ドメインまたはポケットは、タンパク質間相互作用、タンパク質-RNA/DNA相互作用、または酵素構造の立体構造変化に関与している可能性があります。亜鉛結合ドメインは、通常、亜鉛フィンガーモチーフやメタロプロテアーゼ[2][40][41]などの約10~30アミノ酸の範囲内にある少なくとも3つの保存されたシステインおよび/またはヒスチジン残基で構成されます。しかし、RdRpでは、デングRdRpの結晶構造で特定されたものなどの亜鉛結合ポケットの存在の前例はほとんどありません[42]。EAV nsp9アミノ酸配列の配列解析により、保存されたシステインおよび/またはヒスチジンが豊富なパッチが欠如していることが明らかになりました。対照的に、SARS-CoV nsp12のアミノ酸配列を調べたところ、H295-C301-C306-H309-C310とC799-H810-C813-H816という2つのパッチが明らかになった。nsp12の結晶構造は現在入手できないが、酵素のC末端の3分の2を表す予測構造が発表されている[31] 。興味深いことに、このモデルでは、C799、H810、C813、およびH816は、デングウイルスRdRpのモチーフEに見られるZn2亜鉛結合ポケット内のZn 2+配位残基の空間配置に似ている(補足図S3を参照)。明らかに、この研究で記録された RdRp 活性に対する Zn 2+誘導阻害効果についてさらなる洞察と構造的根拠を提供するには、構造解析とそれに続く前述のシステインおよびヒスチジンをターゲットとした変異研究などによる、ニドウイルス RdRp の詳細な分析が必要です。ただし、Zn 2+結合が本質的に非常に一時的であり、現在利用可能な方法では検出できないことが判明した場合、このような研究は複雑になる可能性があります。

要約すると、亜鉛イオンと亜鉛イオノフォアPTの組み合わせは、細胞培養におけるニドウイルスの複製を効率的に阻害する。これは、亜鉛イオノフォアを抗ウイルス化合物として使用することについてのさらなる研究の興味深い基礎を提供するが、全身的影響を考慮する必要があり[43][44]、マウス異種移植モデルにおける腫瘍に対して有効な濃度ではそのような化合物に全身毒性がないことが明らかであることを考えると、水溶性亜鉛イオノフォアの方が適している可能性がある[45]。in vitroでは、Zn 2+によるRdRpの可逆的阻害は、(ニド)ウイルスRNA合成の分子的詳細に関する洞察を深めるための便利な研究ツールも提供し、SARS-CoVとEAVのRdRp間の新しいメカニズムの違いを明らかにした。

材料と方法

細胞とウイルス

Vero-E6細胞を培養し、SARS-CoV(フランクフルト1株、アクセッション番号AY291315)またはSARS-CoV-GFPを感染させた。感染させたSARS-CoVを扱うすべての手順は、ライデン大学医療センターのバイオセーフティレベル3施設で実施された。BHK-21またはVero-E6細胞を培養し、EAV(Bucyrus株、アクセッション番号NC_002532)またはEAV-GFPを感染させた。感染させたEAVは、他の文献で説明されているように[25 ]

細胞培養におけるニドウイルスの複製に対する亜鉛イオンの影響

感染前日に、Vero-E6細胞を透明または黒色(低蛍光)の96ウェルクラスターに1ウェルあたり10,000細胞で播種した。翌日、細胞をmoi 4でSARS-CoV-GFPまたはEAV-GFPに感染させ、感染後1時間で接種物を除去し、2%ウシ胎児血清(FCS)を含む培地100 µlを各ウェルに加えた。一部の実験では、0~2 µM ZnOAc 2に加えて、0~32 µMのピリチオン(Sigma)を加えた。感染細胞を感染後17時間で、培地を吸引し、PBS中の3%パラホルムアルデヒドを加えることで固定した。PBSで洗浄した後、LB940 Mithrasプレートリーダー(Berthold)で485 nmの蛍光を測定してGFP発現を定量した。 ZnOAc 2および PT の毒性を調べるため、細胞を 0~32 µM PT および 0~8 µM ZnOAc 2に曝露しました。18 時間培養後、細胞生存率は Cell Titer 96 AQ MTS アッセイ (Promega) で測定しました。EC 50および CC 50値は、Graphpad Prism 5 の非線形回帰モデルを使用して計算しました。

RNAテンプレートとオリゴヌクレオチド

RNAオリゴヌクレオチドSAV557R(5′-GCUAUGUGAGAUUAAGUUAU-3′)、SAV481R(5′-UUUUUUUUUUAUAACUUAAUCUCACAUAGC-3′)およびポリ(U)185′-UUUUUUUUUUUUUUUUU-3′)はEurogentecから購入し、7 M尿素/15%PAGEゲルから精製し、NAP-10カラム(GEヘルスケア)で脱塩した。 RNA 二重鎖 SAV557R/SAV481R をアニールするために、オリゴヌクレオチドをアニーリング バッファー (20 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM NaCl、5 mM EDTA) で等モル比で混合し、90°C に加熱して変性させ、室温までゆっくり冷却した後、15% 非変性 PAGE ゲルから精製しました。

単離RTCを用いたin vitroウイルスRNA合成アッセイ

SARS-CoVおよびEAV RTCは感染細胞から分離され、以前に記載されたようにin vitroで活性を測定した[25][26] 。Zn 2+の効果を評価するために、1 µlのZnOAc 2ストック溶液を標準の28-µl反応に加え、最終的なZn 2+濃度が10~500 µMになるようにした。反応中にZn 2+をキレート化する必要がある場合は、マグネシウム飽和EDTA(MgEDTA)を最終濃度1 mMになるように加えた。RNAを単離した後、 32 P標識反応生成物を変性1%(SARS-CoV)または1.5%(EAV)アガロースホルムアルデヒドゲルで分離した。ウイルスRNAへの[α- 32P ]CMPの取り込みは、Typhoonスキャナー(GE Healthcare)とImageQuant TL 7ソフトウェア(GE Healthcare)を使用して乾燥ゲルのリン光イメージングによって定量化されました。

ニドウイルスRdRpsの発現と精製

SARS-CoV nsp12およびEAV nsp9は、基本的に他の文献[27][28]で説明されているとおりに精製されたが、nsp9については改変が加えられた。簡単に説明すると、プラスミドpDEST14-nsp9-CHを含む大腸菌BL21(DE3)を、自己誘導培地ZYM-5052 [47]で37°Cで6時間、さらに20°Cで16時間培養した。緩衝液A(20 mM HEPES pH 7.4、200 mM NaCl、20 mMイミダゾール、および0.05% Tween-20)で溶解した後、上清をHisTrapカラム(GE Healthcare)に適用した。溶出は、緩衝液 A 中の 20~250 mM イミダゾールの勾配で行いました。nsp9 を含む画分は、Superdex 200 カラム (GE Healthcare) で 20 mM HEPES、300 mM NaCl、0.1% Tween-20 のゲルろ過によりさらに精製しました。nsp9-CH を含む画分をプールし、1000 倍量の緩衝液 B (20 mM HEPES、100 mM NaCl、1 mM DTT、50% グリセロール) に対して透析し、-20°C で保存しました。 D618A(SARS-CoV)またはD445A(EAV)変異を持つRdRpsは、他の文献で説明されているように、野生型(wt)プラスミドpDEST14-nsp9-CH [28]にオリゴヌクレオチド5′-TACTGCCTTGAAACA GCC CTGGAGAGTTGTGAT-3′および5′-ATCACAACTCTCCAG GGC TGTTTCAAGGCAGTA-3′を、およびプラスミドpASK3-Ub-nsp12-CHis 6にオリゴヌクレオチド5′-CCTTATGGGTTGG GCT TATCCAAAATGTG-3′および5′-CACATTTTGGATA AGC CCAACCCATAAGGA-3′をそれぞれ導入した部位特異的変異誘発によって得られた[27]。変異タンパク質はwt酵素と並行して精製された。

精製酵素を用いたRdRpアッセイ

0.1µMの精製SARS-CoV nsp12を用いたRdRpアッセイの標準的な反応条件は、他の文献に記載されている[27] 。このアッセイにおけるZn2 +の効果を調べるために、0~80mM ZnOAc2の希釈系列0.5µlを5µlの反応混合物に加え、最終Zn2 +濃度を0~8mMとした。 EAV RdRp アッセイには、1 µM nsp9、1 µM RNA テンプレート poly(U) 18、0.17 µM [α- 32 P]ATP (0.5 µCi/µl; Perkin-Elmer)、50 µM ATP、20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM NaCl、10 mM KCl、1 mM MnCl 2、4 mM MgOAc 2、5% グリセロール、0.1% Triton-X100、1 mM DTT、および 0.5 単位 RNaseOUT が含まれていました。ZnOAc 2 を反応に加え、最終濃度が 0~6 mM になるようにしました。反応中に Zn 2+をキレート化するために、MgEDTA を最終濃度が 8 mM になるように加えました。反応は1時間後に終了し、[27]に記載の通りに分析した。

SARS-CoV nsp12電気泳動移動度シフトアッセイ

SARS-CoV RdRpを0.2 nM 5′32P標識SAV557R/SAV481R RNA二本鎖と6 mM ZnOAc2の存在下または非存在下で30℃で10分間インキュベートした。反応は以前に記載された方法[27]に従って分析した。

サポート情報

図S1

SARS-CoV nsp12のRdRp活性に対するさまざまな二価カチオンの影響。精製された組み換えSARS-CoV nsp12を、プライミングテンプレート、ATP、[α- 32 P]ATPとともに、6 mM Mg 2+のみ(レーン1)、または2番目の二価金属(M 2+)の濃度を徐々に増加させて、具体的には2~6 mM Ca 2+(レーン2~4)、2~6 mM Co 2+(レーン5~7)、2~6 mM Zn 2+(レーン8~10)、または2~6 mM Mn 2+(レーン11~13)の存在下でインキュベートしました。最も強い阻害が観察されたのはZn 2+でした。SARS-CoV nsp12 RdRpアッセイの詳細については、本文を参照してください。

(1.55 MB TIF)

図S2

EAV nsp9のジヌクレオチド伸長活性に対するZn 2+の影響。精製された組み換えEAV nsp9を、 [α- 32 P]ATP、ATP、4 mM Mg 2+、1 mM Mn 2+、および1 µM ApAの存在下でU 18テンプレートとともにインキュベートした。( A ) 反応混合物を2つのアリコートに分け、そのうちの1つに6 mM Zn 2+を添加し、レーンの上に示した時点(分)でサンプルを採取した。Zn 2+の非存在下では、EAV nsp9はde novoを開始し、それぞれA2とA3で示されるジヌクレオチドとトリヌクレオチドを生成する。A2とA3の間にあるRdRp活性とは無関係な非特異的バンドはアスタリスクで示されている。6 mM Zn 2+の存在下では、ジヌクレオチドとトリヌクレオチドの合成はブロックされた。 ( B ) ( A ) で説明したアッセイを Zn 2+の非存在下で実施すると、18 ヌクレオチドの完全長産物が形成される。この産物は、アッセイを 6 mM Zn 2+の存在下で実施した場合には観察されないが、nsp9 は提供されたジヌクレオチドプライマー ApA をトリ (ApA*pA) およびテトラヌクレオチド ((ApA*pA*pA) 産物に伸長することができた (アスタリスクは放射性標識リン酸を示す)。5′ トリリン酸基が存在しないため、これらの反応産物は、この分析に使用した 20% アクリルアミドおよび 7 M 尿素ゲル中で非常にゆっくりと移動します。EAV nsp9 RdRp アッセイの追加の実験詳細については、本文を参照してください。

(2.16 MB TIF)

図S3

SARS-CoV nsp12の予測構造における推定亜鉛結合残基と、亜鉛含有デングウイルスRdRpドメインの構造との比較。 ( A )コロナウイルスRdRpの配列アライメント。コロナウイルスnsp12のC末端領域で4つの潜在的な亜鉛結合残基アミノ酸(SARS-CoVのC799-H810-C813-H816、アスタリスクで示す)が保存されていることを示す。黒の網掛けはコロナウイルス間で完全に保存されていることを示す。コロナウイルスRdRp配列はMuscle 3.6にアライメントされた。整列された配列と NCBI アクセッション番号は次のとおりです: マウス肝炎ウイルス株 A59 (MHV_A59; NP_068668)、ヒト CoV 229E (HCoV_229E; NP_068668)、感染性気管支炎ウイルス株 Beaudette (IBV_B; P0C6Y1 )、ウシコロナウイルス (BCoV; NP_742138.1)、ネココロナウイルス (FeCoV; YP_239353.1)、および SARS-CoV 株 Frankfurt-1 (SARS_Fr1; AAP33696 )。 ( B ) デングウイルス RdRp ドメインの結晶構造。モチーフ E (赤で表示) の近くにある Zn 2+結合ポケット Zn2を形成する 4 つのシステインおよびヒスチジン残基の位置を示しています。 2番目のZn 2+結合ポケット(Zn1)と結晶構造で特定された2つの亜鉛イオンは青灰色で示されています。(C)PDBコード1O5Sに基づくSARS-CoV nsp12(Xu et al.、Nucl. Acids Res. 31:7117–7130)の予測3次元構造モデル。Swiss-PdbViewer 4.01とPOV-Ray 3.6でレンダリングされています。パネルAに示されている保存されたシステインとヒスチジン残基(C799-H810-C813-H816)の位置は、モチーフE(赤で表示)とRdRp活性部位残基(D618、D760、およびD761)の近くに示されています。このモデルにおけるこれらのシステインとヒスチジンの空間配置は、デングウイルスの RdRp ドメインにある Zn 結合ポケット Zn2 の金属イオン配位残基の配置と驚くほど似ています (パネル B を参照)。

(0.86 MB TIF)

脚注

 

著者らは、利益相反は存在しないと宣言した。

 

 

この研究は、オランダ科学研究機構 (NWO) の支援を受け、化学科学評議会 (NWO-CW 助成金 700.55.002 および 700.57.301) および NWO Toptalent 助成金 (021.001.037) から助成金を受けて実施されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備には一切関与していません。

 

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Post Author: akali

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